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內(nèi)源性化合物是機體內(nèi)已存在的和代謝過程中所形成的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，包括維生素、激素、蛋白質(zhì)及電解質(zhì)等。內(nèi)源性化合物廣泛分布于機體內(nèi)，在細胞增殖、組織修復(fù)、疾病診斷和治療、機體自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)前，內(nèi)源性化合物發(fā)展的瓶頸效應(yīng)已經(jīng)由生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到評估和定量上。內(nèi)源性化合物的定性和定量分析是非常復(fù)雜和困難的，干擾成分多、基質(zhì)效應(yīng)大、濃度范圍狹窄或周期性變化等都是影響內(nèi)源性化合物定量的重要因素。此外，目前尚無關(guān)于內(nèi)源性化合物分析方法驗證的統(tǒng)一指南，這也是制約內(nèi)源性化合物應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

內(nèi)源性化合物精準(zhǔn)定量分析在非臨床和臨床研究中意義重大，隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，LC-MS/MS已成為內(nèi)源性化合物定量分析首選工具。內(nèi)源性化合物定量分析包括相對定量、半定量和絕對定量，絕對定量可細分為標(biāo)準(zhǔn)加入法、背景扣除法、替代分析物法和替代基質(zhì)法，其中替代基質(zhì)法應(yīng)用最為廣泛。內(nèi)源性化合物絕對定量因缺少真正意義上的空白基質(zhì)，故在其分析過程中尋找合適的替代基質(zhì)是重中之重工作。常見的替代基質(zhì)包括純?nèi)芤骸⑷斯せ|(zhì)和不含分析物真實基質(zhì)。

1.純?nèi)芤?/span>

純?nèi)芤菏亲詈唵纬Ｓ玫奶娲|(zhì)之一，最常見的純?nèi)芤簽樗土鲃酉啵褂眉內(nèi)芤鹤鳛樘娲|(zhì)需要驗證分析物提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)是否和真實基質(zhì)具有一致性。表1總結(jié)了近年來利用純?nèi)芤鹤鳛樘娲|(zhì)進行定量分析的內(nèi)源性化合物。例如，人血清中血栓素B2和12（S）-羥基二十碳四烯酸替代基質(zhì)選用水/甲醇/乙腈(80:10:10, v:v:v)，大鼠全血和肝臟勻漿液中丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）替代機制為水/三氯乙酸(90:10, v:v)，大鼠骨骼肌勻漿液葡糖腦苷脂(GC)定量分析替代基質(zhì)為甲醇。

表1 純?nèi)芤禾娲|(zhì)總結(jié)表

2.人造基質(zhì)

人造基質(zhì)選擇原則是不含分析物且成分、鹽含量、分析物溶解度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)方面與真實基質(zhì)類似。常見的人造基質(zhì)包括PBS(pH7.4)、牛血清蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）等，牛血清蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）常見濃度為20~80g/L。例如，大鼠全血和皮膚勻漿液中左旋肉堿（MC）定量分析替代基質(zhì)為BSA水溶液（2g/L），人血漿中不飽和脂肪酸和生長素定量分析替代基質(zhì)為等滲鹽水溶液。表2和表3為常見的人造基質(zhì)。

表2 常見人造基質(zhì)組成成分

表3 人造基質(zhì)作為替代基質(zhì)總結(jié)

3.不含分析物真實基質(zhì)

制備不含分析物的真正基質(zhì)，前提是真正的生物基質(zhì)中含有的被分析物濃度非常低，或者是被分析物可通過物理或者化學(xué)手段剔除。當(dāng)分析物如抗壞血酸在生物基質(zhì)中易被氧化時，或者如β-胡蘿卜素對空氣和光照不穩(wěn)定，可利用氧化手段或者增強光照消除被分析物以得到真實空白基質(zhì)。生物樣品中內(nèi)源性酯或內(nèi)酯類化合物可通過酶解方法孵化樣品消除內(nèi)源性酯和內(nèi)酯從而制備需要的基質(zhì)。

活性炭較強的吸附功能賦予其較強的內(nèi)源性化合物結(jié)合能力進而除去被分析物以獲得真實空白基質(zhì)。利用LC-MS/MS定量分析人全血中膽紅素替代基質(zhì)制備選用活性炭與生物基質(zhì)按照一定質(zhì)量體積（1：3）循環(huán)3次獲取。活性炭吸附制備空白基質(zhì)需注意清除殘留活性炭減少分析批間差異。此外，抗體的特異性結(jié)合能力可定向結(jié)合生物基質(zhì)中被分析物，利用吸附有特異性親和抗體試劑盒或者分離柱消除分析物可較理想獲取空白基質(zhì)。表4是制備真實空白基質(zhì)進行定量分析的內(nèi)源性物質(zhì)。

圖4 真實空白基質(zhì)制備

參考文獻

1. Rhishikesh Thakare, Yashpal S. Chhonker, Quantitative analysis of endogenous compounds. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 128 (2016) 426–437.