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宮頸炎癥又稱宮頸糜爛，是常見婦科宮頸病變疾病之一，是慢性宮頸炎發病進程中常見的局部病理性改變。宮頸管黏膜上皮由單層柱狀上皮構成，抗病毒感染能力差，易受條件致病菌影響。相關研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）長時間持續感染，尤其是HPV16、HPV18等黏膜高危致癌性的病毒，一定程度上增加了宮頸上皮的瘤變，也提高了宮頸癌的發生率，HPV16和HPV18與世界上70%～76%的宮頸癌相關。同時，加德納菌等條件致病菌所引起的黏液膿性宮頸炎會增加HPV的感染風險，進一步提高了宮頸癌的發生風險。椿乳凝膠的處方組成為：椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片5味藥，具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，其功能主治為濕熱淤阻型慢性宮頸炎。臨床藥理學研究報道：該方具有抗炎、活血化瘀、收斂消腫的功效，能促進正常鱗狀上皮細胞再生，消除病因，清除局部感染及壞死組織，促進正常宮頸細胞的修復再生。因此，本文采用HPV陽性的宮頸癌細胞CaSki和Hela，就椿乳凝膠清除各類黏膜高危型HPV和調節陰道菌群平衡，治療宮頸炎癥和預防宮頸癌的機制進行如下研究。

1、材料

1.1  試藥

 椿乳凝膠（規格：4 g/支，批號：20180804，株洲千金藥業股份有限公司）。西多福韋CDV（批號：20171125，軍事醫學科學院微生物流行病研究所）。高糖DMEM培養基（批號：AB10201637，HyClone公司）；胎牛血清（Sciencell公司，批號：M048-6）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（批號：3211713）、CCK-8（批號：B34304）（Bimake公司）；HPV16 E6抗體/ HPV18 E6抗體（批號：GR247586-18）、HPV16 E7抗體（批號：GR264171-1）、HPV18 E7抗體（批號：GR241906-1）（Abcam公司）；HEPES（Sigma公司，批號：SLBQ1006V）；朊蛋白胨（BD公司，批號：6060563）；新鮮酵母提取物（GIBCO公司，批號：1819083）；馬血清（Solarbio公司，批號：912I051）；沙氏葡萄糖液體培養基（青島海博生物技術有限公司，批號：20150921）。

1.2  細胞及菌株

  人宮頸上皮細胞H8、人宮頸癌細胞CaSki（HPV 16陽性）、人宮頸癌細胞Hela（HPV 18陽性）（豪地華拓生物科技有限公司）。加德納菌（GV-10-1）和白假絲酵母菌（浙江欣力菲生物科技有限公司）

1.3 儀器 

3111型CO2培養箱（美國Thermo公司）；DMIL型倒置顯微鏡（德國Leica公司）；MR-96A型酶標儀（深圳邁瑞公司）；CJ-1F型醫用凈化工作臺（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）；Accuri C6型流式細胞儀（美國BD公司）；PowerPacTM Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；BSCIIB2-1101型生物安全柜（上海瑞仰凈化裝備有限公司）；SPX-250B型生化培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2、方法

2.1 細胞培養

將人宮頸上皮細胞H8、人宮頸癌細胞CaSki、人宮頸癌細胞Hela復蘇后接種于5 mL DMEM完全培養基中，轉移至25 cm2的培養瓶中，37℃、5%CO2培養至對數生長期后備用。

2.2  菌株培養

取凍存的加德納菌或白假絲酵母菌，水浴融化后接種至9 mL相應液體培養基試管內并混勻，同時制備一管不加菌液的培養基作為陰性對照管，硅膠塞封口后，將試管置于合適條件下培養24～48 h，分別將加德納菌或白假絲酵母菌用相應培養液配制成濃度為1×107 CFU·mL－1的菌液，備用。

2.3  CCK-8法檢測細胞存活率

取對數期生長的H8、CaSki、Hela細胞，分別以每孔5×103個細胞接種于96孔細胞培養板中，設置溶媒對照組、椿乳凝膠不同濃度組（最大溶解度10 mg·mL^－1為最大濃度，以接近√10為梯度差下設5個濃度：0.03、0.1、0.3、1、3 mg·mL^－1），同時設置西多福韋（3、10、30、100、300、1000 μg·mL^－1）作為陽性對照組，每組6個復孔。采用CCK-8法測定細胞存活情況。

2.4  流式細胞術檢測人宮頸上皮細胞周期

取對數生長期的H8細胞，以5×105個/孔的密度接種至6孔板中，待細胞貼壁后，設置溶媒對照組、椿乳凝膠組（低、中、高濃度），陽性對照組，每組6個復孔。24 h后，常規消化收集細胞，用70%冷乙醇固定過夜，加5 μL的PI，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5  CCK-8法檢測細胞存活率

取對數生長期的CaSki和Hela細胞，以5×105個/孔的密度接種至6孔板中，待細胞貼壁后，設置溶媒對照組、椿乳凝膠低、中、高濃度組，陽性對照不同濃度組，每組6個復孔。24 h后，收集細胞，加入500 μL Binding Buffer緩沖液重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI，在室溫避光條件下孵育15 min，用流式細胞儀檢測凋亡情況。

2.6 HPV16 E6/E7蛋白、HPV18 E6/E7蛋白表達檢測

細胞處理方法同步驟“2.5”項下，處理24 h后分別提取各孔總蛋白，用Western Blot法檢測E6/E7蛋白表達。

2.7  最小抑菌濃度（MIC）測定

將椿乳凝膠配制為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg·mL^－1濃度的混懸液，將西多福韋配制成1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 μg·mL^－1濃度的溶液，各組濃度藥液均放置在試管中。每管中藥液為1.8 mL，各管中加入1×107 CFU·mL^－1加德納菌或白假絲酵母菌懸液200 μL，用透氣硅膠塞塞好試管，同時設置空白對照組（菌液中加入培養基作為對照）、陽性對照組（培養液中不加菌液）。將各管適宜條件下培養48 h，觀察無細菌生長的濃度，即為最小抑菌濃度（MIC），在肉眼觀察后，將肉眼未見渾濁濃度的培養液搖晃均勻，取100 μL上層液體，均勻涂布至相應平板上，進行加德納菌或白假絲酵母菌的活菌計數。

2.8  統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以x±s表示，兩樣本均數的比較采用Student T-Test檢驗，多樣本組間均數的比較采用One-way ANOVA 檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3、結果

3.1 椿乳凝膠對H8、CaSki和Hela細胞增殖的影響 

H8、CaSki和Hela細胞給予不同濃度的椿乳凝膠后，鏡下觀察，H8和CaSki細胞形態學未出現明顯變化，細胞增殖未受到明顯影響，細胞增殖抑制率均＜20%。在高濃度下，Hela細胞出現增殖速度減慢，細胞碎片增多、細胞間的間隙增大、部分細胞呈空泡狀等現象。且Hela細胞狀態與椿乳凝膠濃度有明確相關性，在10 mg·mL^－1濃度條件下可見較多無法維持完整細胞形態，見圖1。經Bliss法計算，得出椿乳凝膠對Hela細胞的IC50＝47.558 mg·mL^－1，從表1可知椿乳凝膠對CaSki細胞的IC50在3～10 mg·mL^－1，TC0＞3 mg·mL^－1；西多福韋對CaSki和Hela細胞的IC50分別為182.100和395.196 μg·mL^－1。細胞存活率≥80%，則認為對細胞無毒性作用，記為TC0，以H8細胞TC0、1/2TC0、1/4TC0為后續實驗的濃度。

因此，椿乳凝膠高、中、低終濃度設置為5、2.5、1.25 mg·mL^－1，西多福韋終濃度為100、50、25 μg·mL^－1。

圖 1　各組對人宮頸上皮細胞H8（A）、人宮頸癌細胞CaSki（B）和Hela（C）的細胞毒性作用

表1　各組H8、CaSki、Hela細胞的增殖

3.2　椿乳凝膠對人宮頸上皮細胞周期的影響 

  細胞周期分析結果顯示：在G0/G1細胞比例明顯減少，S期細胞比例增加，G2/M期細胞比例明顯增加，表明其對宮頸上皮細胞的修復作用可能是通過減少間期休眠的細胞，促進其進入G2/M期，促進細胞分裂，從而加速受損上皮細胞的更新。詳見表2。

表2　各組人宮頸上皮細胞H8的周期(n＝6，x±s)

 3.3　椿乳凝膠對宮頸癌細胞凋亡的影響

椿乳凝膠5 mg·mL^－1處理時，與溶媒對照組比較，CaSki及Hela細胞凋亡率差異均具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。西多福韋各濃度組時CaSki和Hela細胞凋亡率與溶媒對照組相比具有明顯差異（P＜0.01），且具有濃度-效應關系。詳見表3和圖3～4。

圖 3　椿乳凝膠對人宮頸癌細胞CaSki凋亡的影響

圖 4　椿乳凝膠對人宮頸癌細胞Hela凋亡的影響

3.4　椿乳凝膠對HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7蛋白表達的影響

在給予不同劑量的椿乳凝膠后，從CaSki和Hela細胞提取的總蛋白中HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7蛋白表達均下調，提示椿乳凝膠清除HPV與下調E6/E7蛋白有關。結果詳見圖5～6。

圖 5　椿乳凝膠對CaSki細胞攜帶的HPV16 E6/E7表達的影響

圖 6　椿乳凝膠對Hela細胞攜帶的HPV18 E6/E7表達的影響

3.5　椿乳凝膠對加德納菌和白假絲酵母菌最小抑菌濃度的影響 

取連續倍比稀釋的椿乳凝膠藥液或西多福韋與稀釋菌液恒溫培養，鏡下觀察測定椿乳凝膠或西多福韋對不同菌株的最小抑菌濃度。結果顯示，椿乳凝膠有效成分中含有抑菌成分。椿乳凝膠對加德納菌和白假絲酵母菌均有不同程度的抑菌作用，椿乳凝膠對加德納菌和白假絲酵母菌的最小抑菌濃度分別為62.5、125 mg·mL－1。西多福韋對加德納菌和白假絲酵母菌均無明顯抑菌作用。

4、討論

宮頸癌具有潛伏周期長的特征，是女性常見惡性腫瘤之一。研究表明，大部分感染HPV的患者會通過自身免疫系統在幾個月內將HPV完全清除，但無法清除如HPV16、HPV18等高危型HPV，使HPV載量維持在高位，由此導致HPV持續感染，發展成宮頸炎及宮頸癌。HPV感染宿主細胞后，引起宮頸上皮細胞壞死并繼續感染宿主細胞，導致細胞發生基因突變，改變細胞生長調控，破壞局部機體免疫系統引起宮頸癌變。

在正常陰道微環境中，益生菌群及條件致病菌群的豐度、多樣性、密集性呈動態平衡狀態，HPV檢測也通常為陰性。當微環境中菌群穩態遭到破壞時，可增加HPV感染的風險。研究表明假絲酵母菌與HPV感染無明顯相關性，真菌感染也未增加感染HPV的風險，但陰道加德納菌與HPV感染密切相關。

椿乳凝膠各中藥組分的現代藥理學研究表明：椿皮、苦參、牡丹皮在體外均具有抑菌作用，同時能夠提高免疫力、升高白細胞抗炎作用等。乳香可鎮痛，增加多核白細胞比例，以吞噬壞死的血細胞，改善新陳代謝，具有消炎作用，可加速炎癥的清除，促進傷口的愈合。

在本實驗條件下，椿乳凝膠對人宮頸上皮細胞H8具有修復作用，可調節H8細胞周期，促進受損宮頸上皮細胞的更新，可促進Hela細胞進入凋亡周期，抑制攜帶有HPV18基因的Hela細胞增殖，對HPV18 E6/E7蛋白表達具有顯著的抑制作用。體外抑菌結果表明椿乳凝膠對引起陰道菌群失調的加德納菌和白假絲酵母菌有一定的抑制作用。

綜上所述，椿乳凝膠治療宮頸炎的機制可能是通過抑制可引起細胞癌變的HPV18 E6/E7蛋白的表達，誘導含HPV18基因的細胞凋亡，殺滅含有HPV18基因的病變細胞，清除已經產生病理性變化的陰道組織，促進正常宮頸上皮細胞的增殖，修復受損的陰道組織。同時椿乳凝膠對引起陰道菌群失調的加德納菌和白假絲酵母菌具有較好的抑制作用，促進陰道菌群平衡的恢復。椿乳凝膠對HPV18的抑制作用和對陰道菌群的調節作用，可協同降低由HPV感染和陰道菌群失調引起的宮頸炎癥向宮頸癌發展的可能性。因此椿乳凝膠在治療HPV感染和調節陰道菌群平衡方面具有良好療效，值得推薦用于HPV及陰道菌群失調引起的宮頸炎，同時可預防HPV感染引起的陰道炎向宮頸癌發展。